蛋白质工程的应用与发展

蛋白质工程是通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质的物理化学性质和分子特性的信息，并在此基础上有目的地设计和修饰编码蛋白质的基因，通过基因工程技术获得能表达蛋白质的转基因生物体系，可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚至细胞体系。

实际应用：

1.提高稳定性

提高蛋白质的稳定性包括以下几个方面：（1）延长酶的半衰期；

（2）提高酶的热稳定性；

（3）延长药用蛋白质的保质期；

（4）抵抗重要氨基酸氧化而引起的活性丧失。

葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用十分广泛，为了提高其热稳定性，朱国平等确定138位甘氨酸（Gly138）为目标氨基酸，随后利用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，将Gly138替换为脯氨酸（Pro138），含有突变体的重组质粒在大肠杆菌中进行表达，结果发现突变体GI的热半衰期比野生型延长了2倍，最适反应温度提高了10~12 ℃，而酶比活力相同。分析认为，Pro取代Gly138后，可能是由于引入了吡咯环，恰好可以填补Gly138附近的空洞，使得蛋白质空间结构更加刚性，从而提高酶的热稳定性。

2.融合蛋白

脑啡肽（Enk）的N端5肽线性结构是与δ受体结合的重要功能区，而干扰素（IFN）是一种广谱的抗病毒和抗肿瘤细胞因子。李孟峰等化学合成了EnkN端5肽编码区，通过1肽编码区与人α3干扰素基因相连，在大肠杆菌中表达此融合蛋白。以体外人结肠腺癌细胞和多形性胶质瘤细胞为模型，通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入法检测融合蛋白的抑制活性明显高于单纯干扰素，且纳洛酮竞争阻断实验表明抑制活性的增加是由Enk引导区介导的。

3.活动改变

通常餐后30～60min，人体血液中胰岛素含量达峰值，120～180min内恢复到基础水平，但目前临床使用的胰岛素制剂在注射后120min才达峰值，持续时间为180～240min，与人体生理情况不符。实验证明，胰岛素在高浓度（大于10-5mol/L）时以二聚体形式存在，在低浓度（小于10-9mol/L）时主要以单体形式存在。速效胰岛素的设计目的是为了避免胰岛素形成聚集体。胰岛素样生长因子-I（IGF-I）的结构和性质与胰岛素有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF-I不会形成二聚体。 IGF-I的B结构域（对应胰岛素B链）中的B28-B29氨基酸序列与胰岛素B链的B28-B29相比是反转的，因此将胰岛素B链改为B28Lys-B29Pro，得到单体速效胰岛素，该速效胰岛素已通过临床测试。

4.抗癌酶改造

癌症的基因治疗分为两个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞不受化学药物的伤害，可以增加化疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）能催化胸腺嘧啶和其他结构类似物如更昔洛韦和阿昔洛韦无环鸟苷的磷酸化。更昔洛韦和阿昔洛韦由于缺少3′羟基，能停止DNA合成，从而杀死癌细胞。通过基因突变可以提高HSV-TK催化更昔洛韦和阿昔洛韦的能力。从大量随机突变中筛选出一个，在酶活性位点附近6个氨基酸被替换，催化能力分别提高了43倍和20倍。O6-烷基鸟嘌呤是用烷化剂处理DNA后形成的主要诱变剂和细胞毒素，包括化疗用的亚硝基药物，因此这些亚硝基药物的剂量是有限的。O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（AGT）将鸟嘌呤O6上的烷基除去，起保护作用。通过反向病毒转染，在小鼠骨髓细胞中表达并保护人AGT。通过突变处理，获得了一些正突变的AGT基因，且活性高于野生型，发现一个突变基因中第6位脯氨酸被丙氨酸取代。

5.嵌合抗体

免疫球蛋白呈Y型，由两条重链和两条轻链通过二硫键连接而成。每条链可分为可变区（N端）和恒定区（C端），可变区为抗原的吸附位点，恒定区为细胞毒素或其他功能因子的吸附位点。每个可变区的三个部分氨基酸序列变化很大，在三维结构上β折叠（CDR）末端为松散结构，为抗原的结合位点，其余部分为CDR的支持结构。不同物种的CDR结构保守，这使得抗体可以通过蛋白质工程进行改造。鼠源单克隆抗体被人体免疫系统排斥，其潜在的治疗益处无法得到发挥。嵌合抗体是将鼠源单克隆抗体的恒定区替换为人源抗体的恒定区，使其免疫原性显著降低。例如用于治疗直肠腺癌（COLORECTALADENOCARCINOMA）的单克隆抗体Mab17-1A。虽然嵌合抗体还存在免疫原性问题，但已有数个嵌合抗体通过了临床试验。所谓人源化抗体，就是将抗原吸附区移植到人抗体上，使抗体上的外源肽链减少到最低限度，使免疫原性降到最低限度。但当只将CDR转导到人抗体上时，其抗原吸附能力非常小，必须携带几个框架氨基酸残基才能保持原有的吸附能力。这样，免疫原性和抗原吸附性就成了矛盾。氨基酸逐一替换或计算机模拟分析可以在保持原有吸附性的情况下，尽可能降低免疫原性。CAMPATH-1H是第一个在临床上用于治疗淋巴肉芽肿病和类风湿关节炎的人源抗体，尽管疗效显著，但超过一半的患者有免疫反应。然而，其他人源化抗体，例如用于治疗脊髓白血病的 ANTI-CD33，具有微不足道的免疫反应。

 

发展前景：

蛋白质工程是一个不断发展的领域。蛋白质工程的功能已经彻底改变了医疗保健、工业、研究和开发。在本文中，我们总结了蛋白质工程的当前发展趋势，并表明蛋白质修饰不仅从传统方法发展到新方法，而且还为许多具有新特性和新应用的新蛋白质提供了新途径。这篇综述为读者提供了有关蛋白质工程的最新方法和范围以及如何最好地利用这些方法的见解。它还强调了蛋白质工程在未来的重要性，并阐明了几种可以优化和充分探索的方法，以便在工业水平上生产工程蛋白质。显然，随着该领域新方法和新途径的迅速出现，蛋白质工程可能很快就会变得与调整 DNA 一样重要，以有效地设计蛋白质中的目标活动和功能。

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